细胞培养过程中的关键工艺参数——溶氧

　　在细胞培养过程中，溶氧（DO）是影响细胞生长、代谢和产物合成的关键工艺参数。无论是细菌还是细胞培养的生物反应器控制过程中，氧气是维持细胞生存必不可少的条件之一。

　　在细胞培养过程中，溶氧（DO）是影响细胞生长、代谢和产物合成的关键工艺参数。无论是细菌还是细胞培养的生物反应器控制过程中，氧气是维持细胞生存必不可少的条件之一。细胞依赖氧气进行有氧呼吸，以生成能量（ATP）并支持增殖，而溶氧不足会导致细胞代谢转向无氧途径，积累乳酸等副产物，引发pH波动和细胞凋亡。在生物反应器的过程控制中，主要利用反应器的MFC模块通过通气管路向培养物中通纯氧来维持细胞培养过程中所需的氧气，细胞以溶氧 (DO) 的形式吸收氧气。溶氧可以通过两种方式提供进入培养基：1. 通过反应器的表通，氧气可以在反应器顶部向培养液表面进行气体交换。2. 氧气通过底部通气鼓泡供应，以微泡和大泡的形式提供不同效率的溶解氧，并通过对流搅拌溶解在培养基中。

　　在细胞培养过程中，溶氧（Dissolved Oxygen, DO）和氧分压（Oxygen Partial Pressure, pO₂）是密切关联但不同的两个概念，它们的区别主要体现在定义、单位和实际应用上。

　　· 溶氧DO：指溶解在培养液中的氧气浓度，表示单位体积液体中氧气的含量（如质量或摩尔数）。单位：常用mg/L、ppm（1 mg/L ≈ 1 ppm）或mM（毫摩尔/升）。能够直接反应在细胞培养物中，细胞生长实际可用的氧气量，是液相中真正溶解的氧分子的绝对量，更加直观地反映出培养液中的氧的“含量”，但是含量受培养物的成分、温度以及压力等因素的影响。

　　· 氧分压pO₂：指气相或液相中氧气在混合气体（如空气）中的分压，反映氧气的热力学活性，与氧传递速率（OTR）直接相关。单位：常用mmHg、kPa或%空气饱和度（如 20% O₂对应约 21 kPa）。能够描述氧气在气液两相的传递驱动力，与亨利定律相关。

　　在细胞培养的生物反应器中，大部分在线电极传感器所监测并体现出来的参数即是溶解氧，作为在细胞培养过程中的关键工艺参数；而氧分压主要常用于过程控制和监测。在线传感器（如荧光或电化学探头）可实时监测DO，结合反馈控制系统优化供氧效率。因此，溶氧的稳定调控是确保细胞培养工艺稳健性和产物一致性的核心要素。

　　C：气体在液相中的平衡浓度（如溶氧DO，单位：mol/L、mg/L或ppm）

　　p：气相中该气体的分压（如氧分压pO₂，单位：atm、kPa或mmHg）

　　比如一个大气压下，氧的平衡分压是101.325*20.947%=21.22455kPa，25摄氏度时氧在水中的亨利系数为4.44*10^6 (kPa),则求出此温度下氧气在水中的浓度为:

　　水在不同温度下的密度可以查相关资料,25摄氏度时为997.044g/L,每升水的摩尔数为:

　　在CHO细胞培养的过程中，反应器溶氧控制水平需根据细胞类型和培养阶段精准控制，溶氧水平通常保持在10-80%之间。过高的氧浓度会导致活性氧 (ROS) 的积累，导致线粒体呼吸链和细胞内氧化还原的改变，最终导致细胞生长抑制和特异性生产力下降。另一方面，低氧条件也会诱导 ROS 积累，抑制细胞生长。因此，在一般实验室规模或者生产规模中，DO的设置常常为40%。VeronicaRestelli等在2.4/4L的培养体系中研究了3、10、50、100和200%的DO对细胞生长、蛋白产量及糖基化的影响，采用CHO-K1细胞系合成(EPO)。

　　不同的DO设定(3、10、50、100和200%)下蛋白的岩藻糖化范围为75-81%，如图2所示，当DO为50%或100%时岩藻糖水平最高为80%左右；而当DO为3、10和200%时，蛋白的岩藻糖水平均在75-76%范围内。即当DO为50%或100%时，岩藻糖化水平最高，随着DO的增加或降低而逐渐降低。

　　图2 在不同 DO 浓度下获得的比生产率与在 50% 空气饱和度下为对照获得的平均比活性相比。偏差表示根据 50%DO 的四个单独实验计算的 SE。* 表示值明显低于对照值。

　　Kunkel等研究了DO对IgG半乳糖化的影响，通过将 DO 设定点控制在 1–100% 空气饱和度之间，免疫球蛋白 （IgG） 的末端半乳糖基化发生了显著变化，二乳糖基化聚糖 （G2） 从高氧水平下的 30% 逐渐降低到低氧条件下的 12% 左右。

　　图3 溶解氧对lgG糖型谱的影响。在三种不同溶解氧条件下细胞生长后，显示无半乳糖基化(G0)、单半乳糖基化(G1)和双半乳糖基化(G2)糖苷的比例

　　Andy A. Lin and William M. Miller等研究了在低氧条件下 CHO-K1 细胞耗氧量的调节和谷胱甘肽水平的调节。报告了由于长时间缺氧或缺氧暴露而导致的耗氧量抑制和供应依赖性关系的改变。抑制的特征是pO2/50（氧消耗达到最大值一半时的氧张力）值的增加（耗氧量为最大一半时的氧张力）。在长期缺氧的情况下，细胞使用氧气的潜力也会降低。在低氧条件下葡萄糖消耗量升高可能导致呼吸抑制。谷胱甘肽浓度在整个缺氧暴露过程中保持不变，但在缺氧下可能会降低多达 40%。当维持于细胞毒性水平的氧 （93%） 时，低氧和缺氧细胞中的谷胱甘肽水平分别比对照细胞增加 2 倍和 4 倍。这表明缺氧和缺氧暴露使 CHO 细胞对氧化应激敏感。

　　氧传质发生在气液两相界面，低部通气的管路将纯氧或者空气通过微孔喷射到培养液中，根据搅拌桨的设计不同，将通入的气泡打散均匀的扩散给细胞提供氧气。液体介质中氧浓度的变化速率取决于 kLa 以及当前可能氧浓度 （CL） 与最大可能氧浓度（或有时称为平衡 – C*）之间的差值。同时，氧浓度变化的速率等于氧转移到培养基的速率 （OTR） 与细胞对氧摄取速率 （OUR） 之间的差值。如果 OTR 高于 OUR 项，介质将不可避免地被氧气饱和，直到达到平衡浓度。另一方面，如果其中 OUR 项大于 OTR，氧浓度将低于所需的水平，将不适合细胞正常生长。

　　OTR 和 OUR 与氧传质系数kLa 相关。基于其相关性的 OTR 决定了细胞培养中可以达到的最高理论细胞密度。Naveenganesh Muralidharan, Emma Bolduc等人在20000L搅拌式反应器中进行氧传质与剪切力的表征实验，为高细胞密度培养工艺放大提供理论依据与实践指导。通过建立预测模型，可准确评估生物反应器支持的最大细胞密度，并优化操作参数以平衡氧气传递与剪切力控制。在实际系统中， kLa 可以相对容易地测量，如当生物反应器运行中的氧气浓度恒定时，可使用稳态方法，即测量进入生物反应器的气流和流出生物反应器的气流中的氧气浓度，两个测量的浓度之间的差异等于氧气从气体到液体的传输速率。或者，当生物反应器中的氧浓度随时间变化时，使用动态方法，在此实验过程中，通过用氮气脱气使氧气浓度为零，随后用空气代替氮气并测量氧气浓度随时间的升高，测量 DO 浓度的变化率。

　　极谱式溶氧电极原理：两极间加恒定电压，电子由阴极流向阳极，产生扩散电流；一定温度下，扩散电流与溶解氧浓度成正比；建立电流与溶解氧浓度的定量关系；仪器将电流计读数自动转换为溶解氧浓度，并在屏幕上显示溶解氧值。

　　在直流极化电压作用下，溶解在水中的氧气穿过半透膜到达阴极发生还原反应，而阳极发生氧化反应，根据电化学过程产生的电流强度计算出氧分压，再根据亨利定律输出溶液中的溶解氧浓度。

　　光学溶氧电极原理：光学氧传感器中，基于物理学中特定物质对活性荧光的淬灭原理。传感器的设计是通过一个发光二极管发出的蓝光照射在荧光帽表面上的荧光物质上，蓝光会激发电极帽涂层上的荧光分子进行跃迁至高能量状态，无氧环境下，高能量荧光分子释放能量发出荧光；在有氧环境下，高能量荧光分子释放的能量一部分转移到氧分子，剩余的能量转化为荧光。荧光分子能量的激发与释放过程通过光的测量来反映氧分压，最后通过亨利定律再计算出氧浓度，最后在经过温度与气压补偿输出溶氧值。